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文献解读

从剩余的葡萄汁和酒渣中生物生产甘露醇期刊：LWT–FoodScienceandTechnology（4.）发表时间：.07研究背景甘露醇（D-甘露醇）是一种六碳糖醇，天然存在于许多生物体中，如细菌、酵母菌、真菌、藻类、地衣和几种植物中。由于其低热量和低致龋性，并且适合糖尿病患者，这种多元醇在食品工业中作为甜味剂和稳定剂而具有多种应用。甘露醇也用于医疗和制药目的。甘露醇的年消费量约为15万吨。目前，甘露醇主要是通过化学合成，通过果糖：葡萄糖混合物（1：1）以雷尼镍为催化剂，在高压和高温下氢化，得到25：75甘露醇：山梨糖醇的混合物。由于该生产路线还存在着技术和经济上的缺陷，因此促进了对该多元醇的替代来源的研究，如从褐藻和白蜡树中提取，酶法和各种微生物发酵。该研究首次评估了使用红葡萄汁和白葡萄汁进行甘露醇生物生产的可行性。在发酵阶段要特别注意对菌株的选择、减少营养供应和和在发酵阶段节省成本，包括使用其他酒厂的副产品(如酒泥)作为微生物的氮源。该研究的目的是开发一种可靠的甘露醇生产方法，该方法可以在不久的将来被与酿酒厂相关的生物精炼厂采纳。研究方法1葡萄汁红葡萄汁（葡萄品种：Garnacha）于年9月采集，白葡萄汁（葡萄品种：Verdejo）于年9月采集，两者均保持在?20?C直至使用。红葡萄汁具有1.10g/mL的密度并含有g/L葡萄糖、g/L果糖、0.34g/L总凯氏氮和0.73g/L总酚类化合物。白葡萄汁具有1.09g/mL的密度，含有g/L葡萄糖、g/L果糖、0.69g/L总凯氏氮和0.15g/L总酚类化合物。它们的阴离子和阳离子组成如表1所示。2酒泥红酒酒泥(RWL)的密度为1.05g/L，含有99.3g/L乙醇、12.2g/L总凯氏氮和1.51g/L酚类化合物。白葡萄酒酒泥(WWL)的密度为1.03g/L，含有81.8g/L乙醇、6.8g/L总凯氏氮和0.43g/L酚类化合物。表1中给出了有关其化学特性的更多信息。3菌株培养评估了三种乳酸菌--菌株发酵乳杆菌CECT、肠系膜明串珠菌CECT和中间乳杆菌NRRLB-的甘露醇产量。在琼脂平板上进行细菌重新激活后，将一个菌落接种到氮气环境下毫升橡胶盖瓶中的50毫升肉汤中，在InforsHTEcotron轨道振荡器中，以rpm和37°C的条件培养24小时。然后，三种细菌悬液各取1.5mL与0.4mL甘油混合并保存在-80°C下。4接种物的制备为了进行菌株选择的初步测试和营养优化实验，将50mL的肉汤放入mL玻璃瓶中。这些溶液用来自每个菌株冷冻保存的原液的一小圈微生物细胞接种，并用橡胶隔膜盖住。向瓶子的顶部空间注入5分钟氮气以创造厌氧条件。将瓶子在InforsHTEcotron轨道振荡器中以rpm和37°C（CECT和NRRLB-）或30°C（CECT）条件下培养24小时，直到可以获得的细胞密度约为1×/mL。5菌种筛选的发酵试验在第一阶段，对三种细菌菌株进行比较，以便为所测试的两种葡萄汁中的每一种选择出最适合生产甘露醇的菌株。红葡萄汁和白葡萄汁分别添加10g/L酵母提取物、0.1g/LMgSO4·7H2O和0.05g/LMnSO4·H2O，用浓NaOH水溶液（2mol/L和g/kg)将他们的pH值调到6，随后让它们在°C下灭菌15分钟，最后加入5g/LCaCO3作为pH缓冲液。6发酵过程中营养添加的优化在为每种葡萄汁选择最合适的菌株后，通过分析最适量的营养补充，进行旨在提高甘露醇产量的优化过程。采用响应面法(RSM)的中心复合设计来确定总初始糖、酵母提取物、MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O（四个自变量）的最合适浓度值，以最大限度地提高甘露醇浓度、甘露醇产量和甘露醇利润因子（三个响应变量）。实验设计由31次实验组成。每个自变量的取值范围如表2所示。研究结果7以葡萄汁为原料生产甘露醇的成本降低策略7.1使用葡萄汁作为接种的生长培养基通过响应面法确定了最佳营养物质浓度后，对各种发酵策略进行了评估以简化工艺和/或降低成本。评估了在稀释的葡萄汁中而不是在Man-Rogosa-Sharpe培养基中制备细菌接种物的可能性。通过用蒸馏水稀释红葡萄汁或白葡萄汁直至达到50g/L的糖浓度来制备液体生长培养基。然后，在稀释的红葡萄汁中添加了7.48g/L酵母提取物和0.g/LMnSO4·H2O，在白葡萄汁中添加了7.54g/L酵母提取物和0.g/LMnSO4·H2O。7.2使用酒泥作为发酵介质中的氮源为了制备发酵培养基，考虑到商业酵母提取物具有g/kg总氮，计算酵母提取物和酒泥之间的当量以获得相同的总氮量。因此，用.3g/L糖、7.48g/L酵母提取物和0.g/LMnSO4·H2O制备可发酵红葡萄汁；而发酵白葡萄汁必须含有.7g/L糖、7.54g/L酵母提取物和0.g/LMnSO4·H2O。8原料和发酵液分析通过使用徕卡DM相差显微镜对Bürker室中的原始样品进行计数来测量细胞密度。葡萄汁和酒泥中的总凯氏氮通过应用NRELTP--方法进行定量，而它们的总酚类化合物浓度则根据Folin和Denis的分光光度法测定。为测定葡萄糖、果糖、甘露醇、乙酸、乳酸和乙醇，原料和发酵样品通过0.20μm孔的尼龙注射器过滤器过滤，然后使用Agilent高效液相色谱设备(带有折光率检测器GA)进行分析。9数据分析响应面法(RSM)使用Minitab16软件进行优化测试。使用statistic7软件进行单因素方差分析和TukeyHSD检验；当p0.05时，差异被认为是显著的。并使用SigmaPlot11进行曲线拟合。研究结果1初始菌株选择在所有情况下，生物质开发都是成功的，三种菌株的细菌密度约为个细胞/毫升，这表明原料适合微生物生长（表3）。一般来说，白葡萄汁的甘露醇产量、葡萄糖消耗量和果糖消耗量高于红葡萄汁，这可能是由于两种原料之间的成分差异所致（表1）。红葡萄汁和白葡萄汁中的三种菌株的糖消耗（尤其是葡萄糖）不足（表3）。这可能与初始糖的浓度过高有关，从而引起底物抑制。该假设将在响应面法优化实验中进行测试，并将评估两种葡萄汁的各种糖浓度(~50–g/L)。2营养补充的优化值得注意的是，红葡萄汁中可以不需要添加MgSO4·7H2O进行发酵，这可能是由于红葡萄汁的矿物质成分中含有足够细菌所需要的镁（表1）。并且正如在红葡萄汁中观察到的那样，白葡萄汁中也可以不添加MgSO4·7H2O进行发酵，这也归功于白葡萄汁中镁的天然含量（表1）。最后，随着初始糖浓度的增加，糖消耗总体呈低度趋势，这支持了底物抑制作用这一假设。当初始糖浓度超过-g/L时，两种葡萄的糖消耗量开始下降。3降低甘露醇生产成本关于不同氮源对甘露醇生产的影响，可以观察到酵母提取物是最有效的化合物，其次是红葡萄酒酒泥和白葡萄酒酒泥（表4）。在所有情况下，甘露醇生产动力学都成功地拟合了Hill方程（图1）。生物质的发展也受到所用氮源类型的强烈影响（表4）。此外，与红葡萄酒酒泥和白葡萄酒酒泥（小时）相比，使用酵母提取物（48小时）的发酵时间明显更短（图1）；这可能是由于细菌在获取酒泥中的氮时遇到了困难，如果对酒泥采用不同或更严格的处理方法，可能会改善这一情况。然而，酒泥中存在的潜在细菌抑制剂不能被丢弃。在补充有红葡萄酒酒泥和白葡萄酒酒泥的发酵液(表4)中检测到的乙醇正是由于这些酿酒厂废弃物中乙醇的自然存在，而非来自于细菌的代谢活动，这可以由乙醇浓度随时间的推移保持稳定看出。在使用红葡萄汁的情况下，使用酵母提取物可以产生68.9g/L甘露醇，而使用红葡萄酒酒泥、白葡萄酒酒泥或不使用营养素时产生的甘露醇浓度分别为酵母提取物的86.3%、74.3%和49.9%（表4）。类似地，在白葡萄汁的情况下，使用酵母提取物可以生产79.8g/L的甘露醇，而使用红葡萄酒酒泥、白葡萄酒酒泥或不使用营养素时，甘露醇浓度分别为酵母提取物的82.2%、72.5%和36.9%（表4）。然而，与没有任何营养补充的对照发酵（29-35g/L甘露醇）相比，用酒泥产生的甘露醇浓度相对较高（红葡萄酒酒泥：60-66g/L甘露醇，白葡萄酒酒泥：50-60g/L甘露醇）（表4）。因此，尽管需要确定适当的处理方法和操作条件以促进氮释放并减少发酵时间，但酒泥依旧是甘露醇生产的重要氮源。图2描述了开发过程。4葡萄汁作为甘露醇生产原料的潜力近年来，为了降低底物成本，人们已通过各种替代农业食品原料试验生产甘露醇，如菊苣、菊芋、腰果、角豆、苹果或甘蔗糖浆（表5)。生产甘露醇的理想果糖:葡萄糖(F:G)摩尔比为2:1；因为三分之二的糖(对应果糖)被还原成甘露醇，而三分之一的糖(对应葡萄糖)被发酵成有机酸、乙醇和二氧化碳。如果F:G比大于2:1，多余的果糖可以与葡萄糖一起用于发酵。相反，当F:G比为1:1时，理论上所有的果糖都会被还原为甘露醇，一半葡萄糖发酵，另一半葡萄糖过量而未被消耗。

结论

利用传统的野生菌株，可以有效地从红葡萄汁和白葡萄汁中生产甘露醇。此外，葡萄在发酵前要能进行微生物繁殖。使用这些原料生产甘露醇的营养需求可以限制在有机氮源和锰盐。在最佳条件下，使用酵母提取物作为氮源,48小时可生产约70-80g/L甘露醇。当酒泥用作氮源时，小时内可得到约50-66g/L的甘露醇。因此，葡萄汁和酒泥是低成本生产生物甘露醇的有前途的基质。以食品生产为导向的生物精炼厂通过利用酒厂的剩余产品和副产品可以为酿酒商带来新的商机，并为农村地区的葡萄酒种植带来了经济复兴的可能性。

GrapeResearch

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